описание

Конструирование трансплантируемой искусственной сосудистой ткани на основе мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани методом клеточного покрытия и криоконсервации

13 Апр 2022

Преваскуляризированные искусственные трехмерные (3D) ткани являются эффективными биоматериалами для регенеративной медицины. Ранее мы создали трехмерную искусственную сосудистую ткань без каркаса из нормальных кожных фибробластов человека (NHDF) и эндотелиальных клеток, полученных из пупочной вены (HUVEC), методом послойного покрытия клеток. В этом исследовании мы сконструировали искусственную сосудистую ткань, построенную из стромальных клеток, полученных из жировой ткани человека (hASCs) и HUVECs (ASCVT), по модифицированной методике с криоконсервацией. ASCVT показал большую толщину с более плотной сосудистой сетью, чем 3D ткань на основе NHDF. Соответственно, 3D-культивированные ASC показали более высокую экспрессию нескольких факторов, связанных с ангиогенезом, включая фактор роста эндотелия сосудов-А и фактор роста печени, по сравнению с NHDF. Кроме того, периваскулярные клетки при ASCVT были обнаружены с помощью маркеров перицитов, что свидетельствует о дифференцировке hASC в перицитоподобные клетки. Подкожная трансплантация ASCVT мышам nude приводила к приживлению трансплантата с анастомозом сосудистых структур хозяина через 2 недели после операции. В пересаженной ткани сосудистая сеть была окружена стеноподобными структурообразующими hASC, в которых некоторые части развились с образованием веноподобных структур через 4 недели, что свидетельствует о формировании функциональных сосудистых сетей. Эти результаты продемонстрировали, что криоконсервированные клетки человека, включая hASC, могут быть использованы непосредственно для создания искусственной трансплантируемой ткани для регенеративной медицины.

Вступление

Регенеративная медицина путем трансплантации искусственных тканей является идеальной альтернативой пересадке органов или когда лечение невозможно осуществить с помощью обычной медицины. Безкаркасное изготовление искусственной ткани клетками человека является направлением регенеративной медицины в связи с ее низкой антигенностью и безопасностью при трансплантации и приживлении1,2. Более того, в медицинских целях предпринимались попытки преваскуляризации искусственных тканей3,4,5, так как кровообращение имеет решающее значение для эффективного приживления искусственных тканей с целью предотвращения дегенерации тканей из-за недостаточного снабжения питательными веществами и кислородом3,6. Однако их применение все еще находится в стадии разработки из-за высокой стоимости, сложности изготовления, биобезопасности при трансплантации человека и отсутствия хорошо зарекомендовавших себя долговременных графтов с сосудистыми функциями7.

В наших предыдущих исследованиях трехмерная (3D) искусственная ткань с сетью кровеносных/лимфатических сосудов была создана с использованием метода накопления клеток с методом послойного покрытия клеток на основе внеклеточного матрикса (ECM)8,9. В этом методе культивируемые клетки человека покрываются слоями фибронектина и желатина, в результате чего образуются нанопленки ECM толщиной 10 нм. Хотя эти клетки свободны от искусственных каркасов, таких как фибриновый гель, они могут формировать трехмерную искусственную ткань в течение короткого времени. Для изготовления сосудистой ткани эндотелиальные клетки, покрытые фибронектином и желатином, культивируют между слоями нормальных дермальных фибробластов человека (NHDF). Они быстро формируют сеть кровеносных и/или лимфатических сосудоподобных канальцев в течение недели9,10. Чтобы подтвердить их функцию, мы трансплантировали трехмерные ткани с сосудистыми сетями, которые были сконструированы с использованием NHDF и эндотелиальных клеток, полученных из пупочной вены человека (HUVEC), в подкожную ткань голых мышей. Выявлено приживление искусственных сосудов, сопровождающееся их анастомозированием с сосудами хозяина и притоком крови3. Более того, лимфатическая сосудистая ткань, сконструированная с использованием NHDFs и дермальных лимфатических эндотелиальных клеток человека, показала ремоделирование сети с образованием структур, подобных кровеносным сосудам, после приживления в заднюю фасцию или подкожную ткань голых мышей 4 . На основании этих исследований мы предположили эффективность искусственных сосудистых тканей, созданных методом накопления клеток, в регенеративной медицине3,4.

Для терапевтического применения искусственных сосудистых тканей использование аутологичных клеток для трансплантации является разумной стратегией, позволяющей избежать отторжения хозяином. Аутологичные мезенхимальные стволовые/стромальные клетки (МСК) являются эффективным биоматериалом для конструирования ткани, обеспечивающей успешное приживление11. В частности, стромальные клетки, полученные из жировой ткани (ASC), считаются привлекательным биоматериалом, поскольку выделение жировой ткани у доноров или пациентов является минимально инвазивным. На сегодняшний день сообщается о большом количестве исследований клеточной трансплантации ASC и их терапевтического применения, и было высказано предположение, что эти клетки индуцируют регенерацию тканей, дифференцируются в ткани хозяина и проявляют иммуномодулирующую активность12,13. Поскольку ASC могут индуцировать регенерацию кровеносных и лимфатических сосудов, эти клетки подходят для лечения ишемических заболеваний и лимфедемы4,14. Для трансплантации также предпринимаются усилия по тканевой инженерии с использованием ASC для создания клеточных слоев15 и 3D-культуры с искусственными каркасами16,17. Что касается применения сосудистой тканевой инженерии, сообщалось о совместном культивировании ASCs и эндотелиальных клеток в фибриновой матрице18,19. Благодаря этим исследованиям инженерия сосудистых тканей скоро достигнет клинических применений. Стратегии без каркасов с простой и быстрой техникой будут способствовать практическому применению в регенеративной медицине.

В настоящем исследовании мы стремились сконструировать трансплантируемую сосудистую ткань на основе человеческих ASC (hASC) методом накопления клеток на основе ECM с добавлением метода криоконсервации, чтобы повысить ее доступность для медицинских исследований и клинических применений. Для этой цели клетки, покрытые нанопленкой ECM, были криоконсервированы в соответствующих условиях и использованы для конструирования тканей (называется методом накопления криоконсервированных клеток; CP-CAM). С помощью этого метода мы сконструировали трансплантируемые ткани сосудов человека на основе hASC, затем оценили in vitro характеристики и подкожное приживление голым мышам по сравнению с тканями на основе фибробластов, как сообщалось в наших предыдущих исследованиях.

Полученные результаты

Формирование сосудистой сети в трехмерной искусственной сосудистой ткани на основе hASC, изготовленной с помощью CP-CAM

В этом исследовании мы разработали CP-CAM, объединив метод накопления клеток с методом криоконсервации. Чтобы оптимизировать условия, мы сначала исследовали формирование сети сосудов с использованием искусственной сосудистой ткани, построенной NHDF и HUVEC, называемой FbVT (дополнительная информация, рис. S1 – S4). Вкратце, наши результаты показали, что клетки, покрытые нанопленкой ВКМ, замороженные с использованием среды для замораживания CultureSure (Fujifilm Wako, в данном исследовании называемой CSFM), содержащей диметилсульфоксид (ДМСО) и альбумин, могут образовывать сеть сосудов после оттаивания (рис. S1e). . Мы проверили, является ли альбумин в CSFM эффективным веществом для CP-CAM, используя нашу оригинальную среду для замораживания, содержащую рекомбинантный человеческий альбумин (относится к ДМСО-альбумину FM, как описано в «Методах»). Было обнаружено образование сети сосудов из клеток, замороженных в ДМСО-альбумине FM, что свидетельствует об эффективности альбумина для этого метода (рис. S1f). Однако более высокий выход живых клеток после оттаивания криоконсервированных запасов наблюдался в CSFM (данные не представлены). Поэтому в этом исследовании мы постоянно использовали CSFM для CP-CAM. По сравнению с FbVT с криоконсервацией или без нее с использованием CSFM не было обнаружено различий в структурах сосудистой сети (дополнительная информация, рис. S3).

Затем мы изготовили искусственную сосудистую ткань, построенную из hASC и HUVEC, называемую ASCVT, с помощью CP-CAM, и структуру ткани сравнили со структурой FbVT. Как показано на рис. 1а, один слой HUVEC культивировали в течение 4 дней между нижним и верхним 4 слоями NHDF или hASC. Срез FbVT показал распределение сосудистой структуры в среднем слое ткани (рис. 1а, FbVT, стрелки), как и в предыдущих отчетах9,10. С другой стороны, ASCVT имел обильное внеклеточное пространство между hASC и был примерно в два раза толще, чем FbVT (рис. 1a, ASCVT и рис. 1b). Распределение сосудистой структуры было не только в средней части, но и в базальном и верхнем слоях ткани (рис. 1а, АСЦТ, стрелки). Трехмерный анализ тканей четко показал эти закономерности распределения сосудистой структуры (рис. 1в, FbVT и ASCVT); цветовая маркировка сосудистой структуры при ФбЖТ и АСЦЖТ по глубине ткани демонстрировала распределение сети в среднем слое ФЗЖТ, а также в верхнем, среднем и нижнем слоях АСЦЖТ. Вертикальное распределение сосудистой структуры показало дополнительные пики в верхнем и нижнем слоях (рис. 1в, АСЦТ, стрелки), что свидетельствует о трехмерном удлинении сосудов при АСЦТ. Кроме того, плотность сосудистой сети при ASCVT была выше, чем при FbVT (рис. 1c). Дальнейший количественный анализ структур сосудистой сети в средней плоскости FbVT и ASCVT подтвердил эти данные. Результаты на рис. 1d-f показали значительно более высокий балл по общей длине, количеству соединений и площади сосудов при ASCVT, чем при FbVT.

Фигура 1

(Сравнение сосудистых тканей, сконструированных с помощью CP-CAM на основе NHDF и hASC. (a) Сосудистые ткани были сконструированы последовательной стопкой из четырех основных слоев NHDF или hASC (B), среднего одиночного слоя HUVEC (V) и верхние четыре слоя NHDF или hASC (T). В течение 4 дней трехмерное культивирование скопившихся клеток привело к образованию искусственных тканей с сосудистыми структурами. Показаны микроскопические изображения срезов, окрашенных толуидиновым синим (FbVT: сосудистая ткань на основе NHDF, ASCVT: сосудистая ткань на основе hASCs). Стрелки указывают на распределение сосудистых структур. (b) Сравнение толщины FbVT и ASCVT (N = 5). (c) Интегрированные конфокальные 3D-изображения CD34-положительных сосудистых сетей человека. в FbVT и ASCVT. Цветные столбцы обозначают глубину вдоль оси z ткани, а изображения сосудов окрашены в соответствии с глубиной тканей. Графики показывают распределение относительной плотности сосудистой структуры по глубине FbVT и ASCVT. , вылупился л ines указывают на глубину среднего сосудистого слоя. Сосудистая сеть ASCVT показала более плотную структуру по сравнению с сетью FbVT и распространяется на верхний и нижний слои, на что указывает многоцветное изображение сосудов. Соответственно, дополнительные пики сосудистого распределения появились в верхних и нижних слоях, как показано красными стрелками. ( d – f ) Количественный анализ общей длины сосудов ( d ), количества соединений ( e ) и площади сосудов ( f ) при FbVT и ASCVT (N   =   6). (g–i) Пролиферацию клеток при FbVT и ASCVT (через 4 дня после посева клеток) оценивают с помощью иммунного окрашивания на Ki67, маркер прогрессирования клеточного цикла. (g, h) Гистологические изображения FbVT (g) и ASCVT (h). Сосудистые структуры визуализируют иммуноокрашиванием на CD31 человека (hCD31). Ki67-позитивные клетки чаще наблюдаются при АСЦЖТ. (i) Количественный анализ показывает, что Ki67-положительная область при ASCVT выше, чем при FbVT (N = 5). Изображения являются представителями пяти независимых экспериментов).

Чтобы оценить, влияет ли пролиферация клеток на толщину ткани, ткани подвергали иммуноокрашиванию на Ki67, маркер пролиферации клеток, и сравнивали положительные области между FbVT и ASCVT (рис. 1g-i). Результаты показали, что Ki67-положительные области в ASCVT наблюдались чаще, что свидетельствует о более высокой частоте пролиферации клеток в этой ткани. Ki67-положительное окрашивание при ASCVT наблюдалось в ядрах как hASC, так и HUVEC.

Мы также оценили влияние криоконсервации на основе CP-CAM на конструкцию ASCVT, поскольку скорость восстановления покрытых и замороженных hASC была ниже, чем у NHDF (дополнительная информация, рис. S2). Как показано на рис. S5, не было никаких существенных различий в структуре сети и толщине ASCVT, построенных с использованием метода замораживания или без него. Этот результат продемонстрировал пригодность замороженных hASC для построения сосудистой ткани в этом исследовании.

Анализ профилей факторов, связанных с ангиогенезом

Приведенные выше результаты продемонстрировали, что проангиогенная/васкулогенная активность hASC более выражена, чем NHDF в 3D-культуре. Для подтверждения ключевых факторов факторы, связанные с ангиогенезом, в культуральных супернатантах культивируемых 2D/3D NHDF и hASC были исследованы с помощью набора Proteome Profilar Human Angiogenesis Array Kit. Мы получили результаты 55 факторов в виде массивов дот-иммуноанализа. Среди них относительные уровни экспрессии тринадцати факторов были повышены при 3D-культивировании по сравнению с 2D-культивированием, как показано на рис. 2. Трехмерная культура NHDFs показала повышенные уровни экспрессии одиннадцати факторов, включая фактор роста эндотелия сосудов-А (VEGF). -A) и фактор роста гепатоцитов (HGF), как показано в нашем предыдущем исследовании9. В настоящем исследовании мы обнаружили повышенное количество других факторов, включая ангиогенин20, амфирегулин21 и PIGF22, медиаторов миграции эндотелиальных клеток и формирования канальцевых структур, таких как CXCL1623, MCP-124, MPP-825 и пролактин26, а также регуляторных факторов ангиогенеза. такие как DPPIV27 и PF428. Трехмерная культура hASC также показала аналогичный профиль повышенной экспрессии факторов, связанных с ангиогенезом. Однако, в частности, интенсивно стимулировались шесть факторов, как показано стрелками на рис. 2. Среди этих факторов повышенная экспрессия FGF-7 (фактор роста кератиноцитов) 29 была обнаружена в 3D-культуре hASCs.

Фигура 2

(Профили факторов, связанных с ангиогенезом, в культуральных супернатантах, собранных из 2D- и 3D-культивируемых NHDF и hASC. Супернатанты культур анализировали с использованием набора Proteome Profiler Human Angiogenesis Array Kit (R&D Systems). Среди 55 факторов, связанных с ангиогенезом, 13 факторов увеличивались в 3D-культивирование по сравнению с 2D-культивированием NHDF или ASC показано на этих графиках (ND: не обнаружено) Стрелки: факторы, специфически увеличивающиеся в супернатанте от 3D-культивирования ASC).

В искусственной ткани, изготовленной методом накопления клеток, в тканевом микроокружении выявлено гипоксическое состояние9. Следовательно, увеличение факторов в 3D-культивируемых hASC может быть связано с гипоксической микросредой. Поэтому мы дополнительно проанализировали профиль в 2D-культивируемых hASC, приготовленных в условиях гипоксии. Как показано на рис. S6, профиль не соответствовал профилям 3D-культивирования.

Перицитоподобная дифференцировка периваскулярных hASCs при ASCVT

На изображении ASCVT с большим увеличением мы наблюдали периваскулярные hASC, прилегающие к основанию эндотелиальных клеток сосудов (рис. 3а, стрелки). При иммуноокрашивании мы обнаружили, что периваскулярные hASC интенсивно экспрессировали человеческий CD90 (рис. 3b, c) и αSMA (рис. 3d, e). Напротив, это интенсивное окрашивание не обнаруживалось в искусственной ткани, созданной hASC без сосудистой сети, хотя небольшое окрашивание наблюдалось над тканью (рис. 3f, g). Затем мы исследовали иммунное окрашивание на маркеры перицитов, такие как NG2 и десмин, и обнаружили положительную реакцию в периваскулярных hASC (рис. 3h–j).

Фигура 3

 

 

(Периваскулярная дифференцировка hASCs при ASCVT. (a) Сильно увеличенное изображение ASCVT, залитого эпоном, и срезов с окрашиванием толуидиновым синим. V сосудистые структуры. Наблюдаются периваскулярно локализованные hASC (красные стрелки). (b–g) Иммуноокрашивание на CD34 человека ( hCD34)/CD90 человека (hCD90) (b,c,f) и CD31 человека (hCD31)/αSMA (d–g). (b–e) ASCVT. Сосудистые структуры (V) иммуноокрашены на hCD34 и hCD31. Периваскулярная локализация hASCs демонстрируют интенсивное иммуноокрашивание для hCD90 и αSMA (c, e). (f, g) Искусственная ткань, созданная hASC без HUVEC. Сосудистые структуры не обнаружены. Наблюдается слабое окрашивание hCD90 и αSMA (h, i) Периваскулярно локализовано hASC, демонстрирующие иммуноокрашивание на NG2 (желтые стрелки). (j) Периваскулярно локализованные hASC, демонстрирующие иммуноокрашивание на десмин (желтые стрелки). (k – m) Добавление hASC, меченных EGFP, к сосудистой ткани на основе фибробластов (NHDF:hASC:HUVECs = 7 :1:1). (k) Иммуноокрашивание парафинового среза. hASCs с EGFP, локализованным в периваске. улярная зона (желтые стрелки). (l) Сильно увеличенное изображение заштрихованного прямоугольника на (k). EGFP-положительные hASC связаны с сосудистой структурой (V). (м) 3D-конфокальное изображение. EGFP-положительные hASC окружали сосудистую структуру наподобие перицита. Ядра клеток визуализировали с помощью DAPI (синий цвет). Изображения являются представителями двух независимых экспериментов).

Для подтверждения периваскулярной локализации hASC с перицитоподобными характеристиками мы сконструировали сосудистую ткань, состоящую из NHDF, hASC, меченных EGFP, и HUVEC в соотношении 7:1:1. Через четыре дня после построения меченые EGFP hASC локализовались вокруг сосудистой структуры и прикреплялись к ней (рис. 3k, стрелки, рис. 3l, m).

Далее мы наблюдали периваскулярную структуру ASCVT с помощью просвечивающего электронного микроскопа (рис. 4). Сосудистая структура, построенная HUVEC, образовывала межклеточные соединения (рис. 4а, красная стрелка), аналогично FbVT (рис. S3g). Наблюдалось взаимодействие между периваскулярными hASC и HUVEC (рис. 4б); желтая стрелка указывает на проекцию hASC, соединенную с базальной частью HUVEC, предполагая образование структуры колышка-гнезда, которая обычно обнаруживается между эндотелиальными клетками и перицитами30,31. Кроме того, кавеолоподобные структуры наблюдались в периваскулярных hASC (рис. 4b, вставка). Мы также наблюдали обильные внутрицитоплазматические филаменты в этих клетках (рис. 4c), что соответствует результатам иммунного окрашивания αSMA на рис. 3d, e. Напротив, некоторые hASC, помимо сосудистой структуры, показали ультраструктуру цитоплазмы, напоминающую структуру фибробластов (Fig. 4d).

Фигура 4

(Ультраструктура hASC, локализованных в периваскулярной области, при ASCVT. (a) Электронная микрофотография ASCVT. V: сосудистая структура, построенная из HUVEC (красный цвет). Наблюдаются межэндотелиальные соединительные соединения (красные стрелки). Также показаны hASC, локализованные в периваскулярной области. ECM: внеклеточный матрица. (b) сильно увеличенное изображение заштрихованного прямоугольника на (а). Проекции hASC взаимодействуют с HUVEC, предполагая образование структуры штифт-гнездо (желтая стрелка). На вставке показано еще одно сильно увеличенное изображение красного заштрихованного прямоугольника, содержащего кавеолы ​​в цитоплазматическая мембрана. (c) Еще одно сильно увеличенное изображение заштрихованного прямоугольника на (а). Цитоплазма периваскулярных hASC демонстрирует филаментную структуру, которая считается наличием актиновых филаментов. На вставке показано еще одно сильно увеличенное изображение красного заштрихованного прямоугольника на цитоплазме (d). ) Изображение hASCs расположено далеко от сосудистых структур.Цитоплазма показывает фибробластоподобную структуру с обильным шероховатым эндоплазматическим ретикулумом (rER) и митохондриями (mt).Изображения повторяют представители трех независимых экспериментов).

Подкожная трансплантация ASCVT голым мышам

Ткани искусственной сосудистой сети (FbVT и ASCVT) вырезали из вставок Transwell через 4 дня после их изготовления и трансплантировали подкожно голым мышам (рис. 5а). Через 2 недели после трансплантации привитые ткани с кожей хозяина собирали, фиксировали и приступали к срезу тканей. Срезы ткани окрашивали гематоксилином и эозином (рис. 5б, г) или иммуноокрашивали виментином человека (рис. 5в, д). Привитый FbVT имел сосудистые структуры, содержащие эритроциты хозяина (рис. 5b, вставка), как сообщалось в предыдущем исследовании3. Иммуноокрашивание на виментин человека показало площадь трансплантата (рис. 5в), а его средняя толщина составила 66,95 мкм (рис. 5е). Напротив, привитая ASCVT генерировала значительно более толстую ткань, чем FbVT (рис. 5e, f). Средняя толщина составила 137,14 мкм, что примерно в два раза больше, чем у FbVT (рис. 5f). В привитом ASCVT капилляроподобные или небольшие венулоподобные сосудистые структуры были распределены в обильной строме (рис. 5g), образуя плотные коллагеновые волокна, как показано окрашиванием Массона-Голднера (рис. 5h). Сосудистые структуры содержали эритроциты хозяина (рис. 5g,h, большое увеличение), что продемонстрировало анастомоз с системой кровообращения хозяина. Двойное иммуноокрашивание на CD34 человека и CD31 мыши/человека показало, что мозаичная структура состоит из эндотелиальных клеток человека и мыши, что свидетельствует об анастомозирующих структурах на периферии области трансплантата (рис. 5i-k).

Фигура 5

(Подкожная трансплантация ASCVT мышам nude. (a) FbVT и ASCVT вырезали из вставок Transwell и подкожно трансплантировали в кожу спины мышей nude. (b–e) Привитые FbVT (b,c) и ASCVT (d,e) ) через 2 недели после трансплантации. (b, d) окрашивание HE; (c, e) иммуноокрашивание на человеческий виментин. FbVT приживается как соединительная ткань, содержащая сосудистые сети с кровью хозяина (b, вставка). Толщина привитого человеческого полученная ткань визуализируется с помощью иммунореакции с человеческим виментином (c). ASCVT также подкожно привит с сосудистыми сетями (d), и толщина была выше, чем у привитого FbVT (e). (f) Количественное сравнение толщины трансплантата между FbVT и ASCVT (N   =   7). ASCVT имеет значительно большую толщину. ( g – k ) Увеличенные изображения привитой ASCVT. ( g ) окрашивание HE. Трансплантат содержит капилляроподобные или небольшие венулоподобные структуры с кровью хозяина ( V ) и обильная строма. (h) окрашивание по Массону-Голднеру для серийных срезов (g). Строма окрашивание коллагеновых волокон, что указывает на строительство соединительной ткани. ( i – k ) Иммуноокрашивание с использованием антител к CD34 человека (красный) и CD31 мыши/человека (зеленый). Привитые сосуды, полученные из HUVEC, являются положительными для обоих антител (i, j). В периферической области трансплантата наблюдаются сосуды с окрашиванием антителами к CD31 мыши/человека и частичным окрашиванием антителами к CD34 человека (i,k), что свидетельствует об анастомотической области между кровообращением хозяина и трансплантата. Ядра клеток на изображениях в темном поле визуализировали с помощью DAPI (синий цвет). Изображения являются представителями трех независимых экспериментов).

Эти результаты продемонстрировали, что ASCVT, сконструированный с помощью CP-CAM, подкожно пересадил соединительную ткань, содержащую сосуды, связанные с кровотоком хозяина.

Сосудистая структура подкожно привитой ASCVT у голых мышей

Далее мы наблюдали структуру стенок привитых сосудов при ASCVT с помощью иммуногистохимии. Через 2 недели после трансплантации CD90-положительные клетки человека окружали сосуды в привитой ткани (рис. 6а), а также αSMA-положительные клетки в серийном срезе (рис. 6б). Эти пристеночные клетки также были положительными по NG2 (рис. 6c), что соответствовало наличию αSMA (рис. 6d–f) и десмина (рис. 6g). На электронной микрофотографии привитых сосудов множественные пристеночные клетки, локализованные вокруг эндотелиальных канальцев (рис. 6з). Подобно нормальным мелким сосудам или капиллярам, ​​базальная часть эндотелиальных клеток и пристеночных клеток имеет структуру штифта-гнезда, в которой эндотелиальные клетки и пристеночные клетки могут быть соединены (рис. 6i, стрелка) 30,31.

Фигура 6

 

(D90-позитивные пристеночные клетки, предположительно полученные из hASC. (b) Иммуноокрашивание на CD31 человека (hCD31) и αSMA в серийном разделе (а). Эндотелиальные клетки положительны по hCD31 в дополнение к hCD34. Пристеночные клетки положительны на αSMA. (c) Иммуноокрашивание на hCD34 и NG2. Пристеночные клетки положительны по NG2, который является маркером перицитов и гладкомышечных клеток сосудов. ( d – f ) Двойное иммуноокрашивание для αSMA и NG2. Объединенное изображение указывало на сосуществование αSMA и NG2 в пристеночных клетках, полученных из hASC. (g) Наличие десмина, еще одного маркера перицитов и гладкомышечных клеток, подтверждено в пристеночных клетках. (h) Электронная микрофотография сосудов в привитом ASCVT. Er: эритроциты, Ec: эндотелиальные клетки, Mu: пристеночные клетки. Расслоение клеток стенки окружало сосуды. (i) сильно увеличенное изображение заштрихованного прямоугольника (h). Обнаружено образование структуры штифта-гнезда между эндотелиальной клеткой и пристеночной клеткой (стрелка). Ядра клеток на изображениях в темном поле визуализировали с помощью DAPI (синий цвет). Изображения являются представителями трех независимых экспериментов).


Мы также подкожно пересадили сосудистую ткань, состоящую из NHDF, меченных EGFP hASC и HUVEC в соотношении 7: 1: 1, и проанализировали приживленную ткань (рис. S7a-c). Почти все hASC, меченные EGFP, локализованы вокруг CD34-позитивных сосудов человека (рис. S7b,c), демонстрируя, что hASC в трансплантате участвовали в построении пристеночной структуры в искусственных сосудах.

Кроме того, для оценки долгосрочного приживления АТЦЖТ мы провели гистологический анализ трансплантата через 4 недели после трансплантации (рис. 7). В этом эксперименте мы использовали меченые EGFP HUVEC для изготовления ASCVT. Хотя в некоторых частях ткани трансплантата произошла замена ткани хозяина, мы наблюдали привитые кровеносные сосуды человека, содержащие эритроциты хозяина (рис. 7a–f). На рис. 7а,б показаны сосуды, похожие на вены, диаметром примерно 50 мкм. Эти сосуды показали положительное иммуноокрашивание эндотелия человека на CD34. Сосуды также продемонстрировали окрашивание на αSMA, человеческий CD90 и NG2 в пристеночной структуре, состоящей из 2–3 слоев пристеночных клеток (рис. 7c–e). Поддерживая рост сосудов, экспрессия Ki67, маркера клеточной пролиферации, была обнаружена в эндотелиальных клетках и пристеночных клетках привитой ткани (рис. S8). Более того, некоторые из эндотелиальных клеток показали EGFP-позитивность (рис. 7f), что доказывает, что эти клетки произошли из искусственных сосудов, сконструированных HUVEC.

Фигура 7

(Кровеносные сосуды в привитом ASCVT через 4 недели после трансплантации. (a–f) Привитый ASCVT через 4 недели после трансплантации. Для каждого окрашивания используются серийные срезы. (a,b) Окрашивание HE. сосуды (V) обнаружены в трансплантате (c–f) Иммуноокрашивание Эндотелий веноподобного сосуда положителен как на CD31 мыши/человека (m/hCD31) (c), так и на CD34 человека (hCD34) (d,e Клетки стенок показывают положительное иммуноокрашивание на αSMA (c), CD90 человека (hCD90) (d) и NG (e), что указывает на то, что эта структура получена из hASCs. (f) Иммуноокрашивание на человеческий виментин и EGFP. Привитый ASCVT был сконструирован с использованием HUVECs, помеченных EGFP. Эндотелиальные клетки показали EGFP-положительное иммуноокрашивание (стрелки), демонстрируя, что сосудистые структуры при ASCVT прижились и построили венозные сосуды, окруженные пристеночными клетками. Ядра клеток в темном поле изображения были визуализированы с помощью DAPI (синий цвет).Изображения являются представителями двух независимых эксперименты).

 

Обсуждение

Эффективные методы криоконсервации стволовых клеток или искусственных тканей позволят сэкономить время и удобно использовать их в медицинских исследованиях и клинических применениях. В связи с этим сообщалось о нескольких методах криоконсервации стволовых клеток, включая ЭСК, иПСК и мезенхимальные стволовые/стромальные клетки, а также о криоконсервации искусственных тканей, таких как клеточные листы и сфероиды32,33,34. В настоящем исследовании мы разработали CP-CAM для создания трансплантируемых искусственных тканей с процессом криоконсервации клеток. В нашей оценке среды для криоконсервации клеток для CP-CAM, CSFM, которая представляет собой коммерчески доступную среду для замораживания клеток, содержащую альбумин, обеспечила наиболее эффективные результаты формирования сосудистой сети. Разработанная нами криоконсервирующая среда (ДМСО-альбумин FM), содержащая рекомбинантный человеческий альбумин, также приводила к эффективному формированию сосудистой сети с помощью CP-CAM, что позволяет предположить, что альбумин потенциально играет роль в сохранении способности замороженных клеток строить сосудистую сеть. Альбумин использовался для криоконсервации клеток или тканей в качестве стабилизатора белков клеточной поверхности в предыдущих исследованиях35,36. Хотя детали механизмов неясны, считается, что альбумин может стабилизировать нанопленки ECM на клеточной поверхности при криоконсервации. CSFM обеспечил лучшие результаты по скорости восстановления после оттаивания, чем ДМСО-альбумин FM (данные не показаны), предполагая, что большее количество факторов в CSFM может способствовать сохранению и построению ткани.

CP-CAM быстрый и удобный для медицинских исследований и клинических применений искусственной сосудистой ткани в регенеративной медицине. После оттаивания клеток из замороженных запасов сосудистая ткань может быть сконструирована в течение 4 дней, что является наибольшей экономией времени по сравнению с другими предыдущими отчетами5. Однако следует отметить, что скорость восстановления после криоконсервации была различной для тестируемых типов клеток. Таким образом, криоконсервация предпочтительна для некоторых типов клеток с высокой скоростью восстановления в сочетании с другими типами клеток, приготовленными без криоконсервации. По сравнению с различными условиями в CP-CAM скорость восстановления клеток после оттаивания не зависела от концентрации клеток и периодов криоконсервации. Эти результаты показали удобство CP-CAM для экспериментов или терапевтических применений с гибким расположением клеток, которые сохраняются в больших масштабах в течение длительных периодов времени.

С помощью CP-CAM мы сконструировали искусственную сосудистую ткань на основе hASC (ASCVT) и сравнили ее структуру с тканью, построенной на основе фибробластов человека (FbVT). ASCVT имел более толстую структуру ткани и развил более плотную сосудистую сеть, чем FbVT. ASCVT продемонстрировал обильное внеклеточное пространство между hASC и большее количество Ki67-позитивных областей в ткани по сравнению с FbVT, что позволяет предположить, что как более высокая секреция внеклеточного матрикса, так и более высокая частота пролиферации клеток при ASCVT влияют на толщину ткани.

Исходя из образования плотной сосудистой сети при ASCVT, мы ожидали обильной продукции факторов, связанных с ангиогенезом, с помощью 3D-культивируемых ASC. Как показано в анализе белкового профиля культурального супернатанта, мы обнаружили замечательную экспрессию шести факторов из hASC, культивируемых в 3D. За исключением PF4 как ангиостатического фактора29, остальные пять факторов (VEGF-A, HGF, пролактин, MCP-1 и FGF-7) являются проангиогенными/васкулогенными24,26,37,38. Хотя в нашем предыдущем исследовании сообщалось о повышенной экспрессии VEGF-A и HGF при 3D-культивировании фибробластов, мы обнаружили более значительную экспрессию этих факторов при 3D-культивировании hASC. Что касается других факторов, то пролактин индуцирует ангиогенез посредством миграции эндотелиальных клеток26, МСР-1 индуцирует экспрессию VEGF-A и тубулярное образование эндотелиальных клеток, а FGF-7 является мощным индуктором ангиогенеза/васкулогенеза29,39. Из этих результатов было показано, что 3D-культивированные hASC с помощью CP-CAM способствуют экспрессии факторов, связанных с ангиогенезом, и обеспечивают индукционные условия для формирования искусственной сосудистой сети.

Поскольку состояние с низким содержанием кислорода было показано в искусственной ткани, изготовленной методом накопления клеток9, мы также исследовали влияние гипоксических условий на сильное продвижение факторов из hASCs и подтвердили отсутствие соответствия профилей экспрессии ангиогенных факторов между гипоксическим 2D-культивированием. и 3D-культивирование hASC. Этот результат свидетельствует о том, что некоторые микросреды, индуцированные в 3D-культуре ASC, но не гипоксия, ответственны за стимулирование факторов, связанных с ангиогенезом, при ASCVT.

В ASCVT мы обнаружили перицитоподобные характеристики в периваскулярных клетках. В этих клетках мы наблюдали интенсивную экспрессию человеческого CD90 и маркеров перицитов, таких как αSMA, NG2 и десмин40, что позволяет предположить, что дифференцировке hASC, возможно, способствует взаимодействие с HUVEC. ASCs, демонстрирующие перицитоподобные характеристики, были обнаружены в сосудистом морфогенезе при высокоплотном культивировании ASCs, которые, как считается, дифференцируются за счет клеточного взаимодействия между гетеротипическими субпопуляциями41. Аналогичным образом, другое исследование показало, что ASC, совместно культивируемые с эндотелиальными клетками в фибриновом геле, проявляют перицитоподобные характеристики, поддерживая и стабилизируя сосудистые структуры19. В жировой ткани ASCs распределяются в периваскулярных областях42, и их иногда считают эквивалентными перицитам из-за общих маркеров и клеточных характеристик40,43. Недавние исследования показали, что ASCs проявляют перицитарный фенотип, стимулируемый NOTCH2 при взаимодействии между эндотелиальными клетками сосудов 44 . Другое исследование также показало, что hASCs действуют как перициты и выполняют иммуномодулирующие функции43. В настоящем исследовании hASCs продемонстрировали перицитоподобную дифференцировку в присутствии сосудистых структур. Однако не все периваскулярные ASC показали это явление, что указывает на то, что может существовать субпопуляция hASC, неспособная к перицитоподобной дифференцировке.

Наряду с этой дифференцировкой перицитоподобные клетки демонстрировали интенсивную экспрессию CD90. Сообщалось, что предшественники адвентициальных перицитов с МСК-подобным фенотипом экспрессировали CD90 с маркерами перицитов45. Кроме того, легочная ткань человека содержала перицитоподобный подтип МСК с экспрессией CD90 и маркера перицитов46. Таким образом, считалось, что такое же периваскулярное поведение субпопуляций hASC будет воспроизведено в нашем настоящем исследовании.

CD90 является одним из распространенных маркеров МСК, включая АСК47. Хотя сообщалось о его участии в самообновлении и дифференцировке МСК, биологическая функция CD90 остается неясной47. Мораес и др. сообщили, что нокдаун CD90 в МСК уменьшает защиту стволовости МСК, делая возможной дальнейшую дифференцировку при наличии специфических стимулов48. Для дальнейшего анализа периваскулярной дифференцировки МСК, включая молекулярные механизмы CD90, ASCVT имеет большой потенциал для использования в качестве экспериментального инструмента.

Подкожная трансплантация ASCVT предполагала их приживление с анастомозом к сосудам хозяина и кровотоком, аналогичным трансплантации FbVT4. Развитие более толстых тканей и плотных сетей сосудов продемонстрировало благополучную тканевую организацию. Было обнаружено, что после трансплантации ASCVT имеет более толстые структуры, чем FbVT, с обильной стромой, образующей плотные коллагеновые волокна, которые могут продуцироваться hASC, и высокой плотностью капилляроподобных сосудистых структур. В трансплантате также наблюдались анастомотические структуры сосудов хозяина и человека, что свидетельствует об инфильтрации клеток-хозяев в трансплантат. Кроме того, Ki67-положительные пролиферирующие клетки были обнаружены в hASC, особенно в периваскулярной области, а также в эндотелиальных клетках. Это утолщает привитый ASCVT под микроокружением тканей хозяина.

На сегодняшний день сообщалось об индукции регенерации тканей и ангиогенеза путем клеточной трансплантации ASCs для терапевтического применения49. Наше исследование показало, что трехмерная искусственная сосудистая ткань без каркаса на основе hASC также может способствовать построению тканей и сосудов как in vitro, так и in vivo. Повышенная экспрессия проангиогенных факторов, показанная при 3D-культивировании hASC, может способствовать этой активности во время процессов in vivo.

Кроме того, мы заметили формирование периваскулярных пристеночных структур hASCs в привитой ткани. Эти структуры проявляли характеристики гладкомышечных клеток перицитов или сосудов (ГМК) с экспрессией NG2, αSMA и десмина. Ранее опубликованные данные показали, что различные стимулы или методы совместного культивирования вызывают дифференцировку ASC в перициты или SMC in vitro41,44,50. Однако об этой дифференциации в привитых искусственных тканях in vivo никогда не сообщалось. Наши результаты ясно продемонстрировали, что на основе hASC периваскулярно собираются и дифференцируются с образованием стеноподобных структур в привитых ASCVT, что свидетельствует о формировании микроциркуляции с функциональными кровеносными сосудами. Считается, что повышенная проангиогенная активность и эффективность hASCs при ASCVT, развившемся in vitro, приведет к успешному приживлению трансплантата со структурным созреванием. Кроме того, в нашем исследовании созревание привитой сосудистой структуры, ориентированной из клеток человека, проявлялось в виде развития сосудов большого диаметра в отдаленные сроки после трансплантации. Этот результат также предполагает развитие функциональной сосудистой структуры путем трансплантации искусственной сосудистой ткани без каркаса. Сообщалось, что покрытие сосудов пристеночной структурой и их взаимодействие необходимо для стабилизации и дальнейшего развития сосудов40,51. Т.о., стенная структура, полученная из hASC, может способствовать созреванию кровеносных сосудов в трансплантированной ткани.

Судя по нашим результатам с помощью CP-CAM, сосудистая ткань на основе ASC с использованием собственных клеток пациента может быть использована для усиления эффективной неоваскуляризации. В этом исследовании HUVEC использовали в качестве источника сосудистой структуры. Для терапевтических целей вместо HUVEC52,53 могут использоваться сосудистые эндотелиальные клетки, дифференцированные из стволовых клеток. Эндотелиальные клетки-предшественники, полученные из периферической крови или пуповинной крови, также доступны54,55. Мы уже подтвердили потенциал эндотелиальных клеток-предшественников, полученных из пуповинной крови человека, с помощью нашего метода конструирования искусственной сосудистой ткани (неопубликованные данные). Эндотелиальные клетки из этих источников позволят конструировать трансплантируемые искусственные сосудистые ткани в качестве материалов для регенеративной медицины ишемических заболеваний, таких как ишемическая болезнь сердца, ишемический инсульт и хроническая ишемия конечностей56,57,58. Для этой цели необходим дальнейший анализ и оценка сосудистой функции, стойкости приживления и безопасности при клиническом использовании.

В заключение, CP-CAM способен к быстрому конструированию преваскуляризированной искусственной ткани с использованием hASC. ASCVT можно было трансплантировать подкожно, и наряду с приживлением трансплантата образовывались зрелые сосудистые сети. Наши результаты показали, что криоконсервированные клетки человека способны в короткие сроки конструировать искусственную трансплантируемую ткань, а собственные клетки пациента, включая ИСК, являются кандидатами для регенеративной медицины. Кроме того, ASCVT станет мощным инструментом для изучения периваскулярной дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в моделях in vitro и in vivo. Понимание межклеточной коммуникации и дифференцировки с использованием этих моделей приведет к раскрытию неизвестных механизмов, управляющих рекрутированием и дифференцировкой мезенхимальных клеток наряду с ангиогенезом в процессе развития и регенерации.

Методы

Культура клеток

Первично культивированные NHDF, неонатальные hASC и HUVEC были приобретены у Lonza (Walkersville, MD). Каждый тип клеток был получен от одного донора. NHDF культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM, Wako Pure Chemical, Осака, Япония), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS, SAFC Biosciences; Lenexa, KS) при 5% CO2 при 37 °C, как описано в нашем предыдущем исследовании4. Для культивирования HUVEC использовали среду для роста эндотелия-2 (Lonza; Walkersville, MD), как описано ранее3. Для культивирования hASC использовали среду для роста мезенхимальных стволовых клеток 2 (Takara Bio Inc., Кусацу, Япония). Вставки Transwell с пористым дном из полиэстера (размер пор: 0,4 мкм) для 24-луночных культуральных планшетов были приобретены у CORNING Inc. (Нью-Йорк, штат Нью-Йорк).

Животные

Самок голых мышей (BALB/cAJcl-nu) в возрасте 6 недель приобретали у CLEA Japan, Inc. (Токио, Япония). Все эксперименты на животных в этом исследовании были одобрены Комитетом по исследованию животных Университета Хиросаки и проводились в соответствии с Руководством по экспериментам на животных Университета Хиросаки. Мышей содержали в условиях контролируемого освещения (12-часовой цикл свет:темнота) и температуры (21 °C). Исследование проводилось в соответствии с рекомендациями ARRIVE.

Построение трехмерной ткани искусственной сосудистой сети человека

Используя метод накопления клеток методом послойного покрытия клеток, мы построили многослойную трехмерную ткань, как описано ранее8,9,10,60. Вкратце, культивируемые клетки (NHDF и hASC в восьмом пассаже или HUVEC в шестом пассаже) собирали путем трипсинизации. Клетки суспендировали в 0,04 мг/мл фибронектина, полученного из бычьей плазмы [FN, Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури)] в 50 мМ трис-HCl-буфере при pH 7,4, и инкубировали в течение 1 мин при осторожном вращении. После этого клетки обрабатывали 0,04 мг/мл желатина свиной кожи [G, Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури)] в 50 мМ трис-HCl-буфере. Девять этапов попеременной обработки FN и G привели к покрытию нанопленки ECM толщиной около 10 нм на каждом типе клеток8,9.

Клетки с покрытием, которые суспендировали в DMEM с 10% FBS, высевали на вставки Transwell. Вставки помещали в 24-луночный планшет для культивирования клеток с добавлением той же среды. Для создания сосудистой ткани ежедневно накладывали четыре нижних слоя NHDF или hASC, один слой HUVEC и четыре верхних слоя NHDF или hASC, а ткани непрерывно культивировали в среде DMEM, содержащей 10% FBS, при 37 °C с 5 % CO2 в течение 4 дней. Альтернативно, NHDF или hASC и HUVEC смешивали в соотношении количества клеток 8:1, высевали на вставки Transwell и культивировали в среде DMEM, содержащей 10% FBS, при 37 °C с 5% CO2 в течение 5 дней. Чтобы подтвердить образование сосудистой сети, всю изготовленную трехмерную ткань подвергали иммуноокрашиванию на CD31 или CD34 человека в соответствии с методом, описанным ниже.

В этом исследовании искусственные сосудистые ткани, сконструированные с помощью NHDF/HUVEC и hASC/HUVEC, называются FbVT и ASCVT соответственно. В этом исследовании для анализа ткани и трансплантации было выполнено не менее 10 раз построения ASCVT.

Метод накопления криоконсервированных клеток (CP-CAM)

Клетки, покрытые нанопленкой ECM, которые были приготовлены, как описано выше в предыдущем методе накопления клеток, были криоконсервированы с использованием нескольких сред для замораживания клеток, как показано на рис. S3a. После покрытия клетки собирали центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 мин при 15 °C, затем ресуспендировали в среде для замораживания клеток (CultureSure Freezing Medium; Fujifilm Wako, Осака, Япония), называемой в данном исследовании CSFM, при концентрации 5 × 105–8 × 106 клеток/мл и помещали на лед. Другие четыре среды для криоконсервации: обычная среда для замораживания клеток [DMEM, содержащая 10 % FBS и 10 % диметилсульфоксида (ДМСО)], CELLBANKER 1 (Takara Bio Inc.), STEMCELLBANKER (Takara Bio Inc.) и наша первоначально разработанная среда для замораживания клеток. [DMEM, содержащий 5 мг/мл рекомбинантного человеческого альбумина, экспрессированного в растениях (Fujifilm Wako, Осака, Япония) и 10% ДМСО], также был исследован как ДМСО-альбумин FM. Суспензию клеток разделяли на аликвоты в криопробирки, выдерживали при температуре - 80 °C в течение ночи, а затем хранили в жидком азоте.

Для создания искусственной ткани криоконсервированные клетки оттаивали в теплой воде при 37 °C в течение 2 минут, ресуспендировали в среде DMEM без сыворотки и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 минут при 15 °C, как показано на рис. S3b. Затем клетки промывали DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, и ресуспендировали в той же среде с соответствующими концентрациями клеток для изготовления искусственной ткани с помощью прежнего метода накопления клеток.

Проверка скорости жизнеспособного восстановления после оттаивания замороженных клеток в CP-CAM

Замороженные клетки (ECM, покрытые нанопленкой NHDF, hASC и HUVEC) в криопробирке (1 мл) оттаивали и подсчитывали общее количество клеток. Затем число сравнивали с числом до замораживания и представляли в виде % скорости восстановления;

𝑅𝑒𝑐𝑜𝑣𝑒𝑟𝑦𝑟𝑎𝑡𝑒 (%) = [𝑐𝑒𝑙𝑙𝑛𝑢𝑚𝑏𝑒𝑟𝑎𝑓𝑡𝑒𝑟𝑡ℎ𝑎𝑤𝑖𝑛𝑔 / 𝑐𝑒𝑙𝑙𝑛𝑢𝑚𝑏𝑒𝑟𝑏𝑒𝑓𝑜𝑟𝑒𝑓𝑟𝑒𝑒𝑧𝑖𝑛𝑔] × 100.

Скорость восстановления NHDF с покрытием из нанопленки ECM или без него и замораживанием в обычной среде также оценивалась для проверки эффективности CP-CAM.

Анализ профиля факторов, связанных с ангиогенезом

После культивирования NHDF и hASC в подходящей среде проводили двумерные (2D) и 3D-культуры. Для 2D-культуры 8 × 105 NHDF или hASC без нанопленки ECM высевали на чашки для культивирования диаметром 3 см с 2,3 мл DMEM и инкубировали в течение 24 часов при 5% CO2 при 37 °C. Для 3D-культуры 8 × 105 NHDF или hASC с нанопленкой ECM высевали на вставки Transwell и инкубировали с 2,3 мл DMEM в течение 24 часов при 5% CO2 при 37 °C. Затем культуральные супернатанты собирали из 2D/3D культур (NHDF или hASC) и использовали для анализа профиля факторов, связанных с ангиогенезом. Экспрессию 55 факторов анализировали с использованием набора Proteome Profiler Human Angiogenesis Array Kit (R&D Systems) в соответствии с протоколом производителя. Количественный анализ выявленных факторов проводили с помощью программного обеспечения FIJI (https://imagej.net/Fiji). Дублированные блоты были получены для каждого фактора, и были рассчитаны их средние баллы.

Трансплантация 3D искусственной ткани сосудистой сети человека

Трансплантацию искусственной сосудистой ткани проводили по методике, описанной в предыдущих исследованиях3,4. Вкратце, FbVT или ASCVT собирали из вкладышей Transwell путем разрезания нижних полиэфирных мембран и хранили в DMEM при 37 °C до трансплантации в подкожную ткань голым мышам. Под анестезией спинную кожу мышей разрезали на длину 1,5 см, а затем подкожно вводили искусственные ткани лицом к искусственной ткани до кожной ткани. Затем рану немедленно зашивали шелковыми швами. Для иммуносупрессии циклоспорин (Неорал, Новартис, Рюэй-Мальмезон, Франция) добавляли в питьевую воду (120 мг/л) за 1 неделю до и на протяжении всего периода приживления, как сообщалось ранее61. Через 2 недели и 4 недели после трансплантации мышей подвергали эвтаназии, затем для гистологического исследования собирали дорсальную кожу, включая трансплантат.

Мечение EGFP hASC и HUVEC с помощью лентивирусной трансфекции

Для флуоресцентного мечения hASC и HUVEC использовали лентивирусную плазмиду CS-CDF-CG-PRE, несущую GFP59. Экспериментальные процедуры были одобрены Комитетом по безопасности генетически модифицированных организмов Университета Хиросаки (регистрационный номер: 16S001-1) и Токийского медицинского и стоматологического университета (регистрационный номер: G2019-026C). Для создания вирусных частиц клетки 293FT котрансфицировали экспрессионной плазмидой pCMV-VSV-G-RSV-Rev и упаковочной плазмидой pCAG-HIVgp с использованием липофектамина 2000 (11668019; Thermo Fisher Scientific). Лентивирусные частицы в супернатантах собирали через 48 ч после трансфекции и инфицировали до 5,0 × 104 hASC или HUVEC на лунку в 12-луночных планшетах для тканевых культур.

Меченные EGFP hASC использовали для визуализации их периваскулярной локализации в искусственной сосудистой ткани. NHDF, HUVEC и hASC, меченные EGFP, покрывали нанопленкой ECM и засевали в соотношении 7:1:1. Через 4 дня после посева ткани фиксировали, заливали и иммуноокрашивали на CD34 человека и EGFP. Эти ткани также подкожно трансплантировали голым мышам, а привитые ткани через 2 недели после трансплантации фиксировали и иммуноокрашивали в соответствии с методом, описанным ниже.

EGFP-меченые HUVEC использовали для визуализации привитых искусственных сосудистых структур человека голым мышам. ASCVT были сконструированы с использованием меченных EGFP HUVEC и трансплантированы подкожно, как описано выше. Привитые ткани через 4 недели после трансплантации фиксировали и иммуноокрашивали на EGFP.

Световая и флуоресцентная микроскопия

Изготовленные искусственные сосудистые ткани во вкладышах Transwell фиксировали 4% параформальдегидом в 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,4) в течение ночи при 4 °C и собирали из вкладышей Transwell путем разрезания нижних полиэфирных мембран. Для достижения полного иммуноокрашивания ткани обрабатывали 0,3% Triton X-100 в 0,1 М фосфатном буфере при 4 °C в течение 3 дней. Затем ткани окрашивали по методике, описанной в наших предыдущих исследованиях3,4,10. Образцы наблюдали с помощью конфокального микроскопа Nikon C2 (Nikon, Токио, Япония). Для гистологического анализа были приготовлены фиксированные искусственные ткани, залитые парафином, а затем были приготовлены серийные срезы тканей толщиной 5 мкм. Привитые ткани, собранные с кожи спины мыши, также фиксировали в 4% параформальдегиде в 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,4) и заливали в парафин. Окрашивание по Массону-Голднеру проводили общепринятым методом. После депарафинизации срезы обрабатывали кислым раствором фуксина, раствором фосфорно-молибденовой кислоты-Orange G и раствором светло-зеленого соответственно. После этого перед наблюдением срезы монтировали с помощью покровных стекол. Иммуногистохимию проводили следующим образом. Депарафинированные срезы дважды кипятили в 10 мМ лимонной кислоте (рН 6,0) в микроволновой печи при мощности 500 Вт по 5 мин каждый для выделения антигена. Затем срезы обрабатывали блокирующим раствором [3% нормальная козья сыворотка (Wako) в 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,4), содержащем 0,05% Tween 20] в течение 1 ч при комнатной температуре и инкубировали с первичными антителами в течение ночи при 4°С. С. Для микроскопии в темном поле срезы визуализировали путем инкубации с флуоресцентно-мечеными вторичными антителами, козьим антимышиным IgG, конъюгированным с Alexa-Fluor 594, или козьим антикроличьим IgG, конъюгированным с Alexa-Fluor 488. Образцы наблюдали с помощью светового микроскопа. BX-50 (Olympus, Токио, Япония) или флуоресцентный микроскоп BZ-X700 (Keyence, Токио, Япония).

Трансмиссионная электронная микроскопия

Фиксатор, содержащий 2,5 % глутарового альдегида и 2 % параформальдегида в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4), использовали для фиксации искусственных сосудистых тканей и приживленных тканей при 4 °С. После этого ткани разрезали на кусочки размером 1 мм × 1 мм и постфиксировали 1% четырехокисью осмия в 0,1 М фосфатном буфере. Затем ткани обезвоживали и заливали в Epon 812 (Nissin EM, Токио, Япония). Ультратонкие срезы толщиной 70 нм готовили с использованием ультрамикротома (REICHERT ULTRACUT S, Leica, Wetzlar, Germany). После окрашивания 4% уранилацетатом и раствором красителя свинца (Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури) ткани исследовали под просвечивающим электронным микроскопом (JEM-1200, JEOL, Токио, Япония).

Количественный анализ данных изображения

Области CD34-позитивной сосудистой сети человека на иммунофлуоресцентных фотографиях выделяли с помощью программного обеспечения Photoshop (Adobe, Сан-Хосе, Калифорния), а их общую длину, ветви и площади определяли количественно с помощью программного обеспечения Image J (https://imagej.nih.gov). /ij/) и анализатор ангиогенеза (http://image.bio.methods.free.fr/ImageJ/?Angiogenesis-Analyzer-for-ImageJ&lang=en). Трехмерный анализ сосудистой сети также был выполнен с использованием программного обеспечения FIJI (https://imagej.net/Fiji).

Ki67-положительные области на иммунофлуоресцентных фотографиях выделяли с помощью программного обеспечения Photoshop и количественно оценивали с помощью программного обеспечения Image J.

Статистический анализ

Статистические сравнения между двумя независимыми группами данных были выполнены с помощью t-тестов. Нормальное распределение всех выборочных данных подтверждалось степенью асимметрии и эксцесса. Затем равенство дисперсий в двух группах данных было подтверждено с помощью F-теста. Для данных с равными или неравными дисперсиями использовали t-критерий Стьюдента или t-критерий Уэлча соответственно. Значения P менее 0,05 считались статистически значимыми.

Ресурс: www.nature.com

Записаться на бесплатную консультацию